|
1 艱難梭菌簡(jiǎn)介
艱難梭菌又叫“艱難梭狀芽孢桿菌”，最早發(fā)現(xiàn)于上世紀(jì)30年代，是造成醫(yī)院感染和住院病患腹瀉的常見(jiàn)。普通人群中約有3%的人的腸胃中都有這種細(xì)菌，在正常情況下，該細(xì)菌受制于人體內(nèi)的其他細(xì)菌，不會(huì)危害人體健康。但對(duì)于長(zhǎng)期或是大量服用抗生素的病人而言，這種細(xì)菌是可怕的，甚至是致命的。這是由于藥物破壞了人體腸胃中各種菌類(lèi)之間的平衡，所以容易導(dǎo)致“艱難梭菌”感染。就“艱難梭菌”本身而言，其致命性并不高，在0.6%到1.5%之間，但由于感染該細(xì)菌通常會(huì)伴隨偽膜性結(jié)腸炎的出現(xiàn)，一旦出現(xiàn)這種情況，死亡率就會(huì)猛增到35%到50%。而且，與所有的細(xì)菌一樣，“艱難梭菌”會(huì)通過(guò)突變產(chǎn)生新的變種，而這些變種細(xì)菌的毒性和對(duì)人體的危害性、致命性通常也更強(qiáng)。
2 艱難梭菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法
所有艱難梭菌菌株皆表達(dá)抗原谷氨酸脫氫酶，但是艱難梭菌分為產(chǎn)毒菌株和不產(chǎn)毒菌株兩種。僅產(chǎn)毒菌株分泌毒素A和毒素B。毒素A和毒素B都可以導(dǎo)致艱難梭菌相關(guān)疾病的發(fā)生。艱難梭菌的檢測(cè)主要是通過(guò)對(duì)疑似病例的糞便中毒素的檢測(cè)完成[1]。直接糞便毒素測(cè)定包括細(xì)胞毒素測(cè)定（CTA）和酶測(cè)定（EIA）[2]。CTA中毒素B的檢測(cè)被認(rèn)為是艱難梭菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[3]。CTA涉及到將培養(yǎng)的細(xì)胞暴露到有或者沒(méi)有抗毒素存在的排泄抽提物中。如果排泄物樣本是艱難梭菌陽(yáng)性，則對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)抗毒處理的培養(yǎng)細(xì)胞有毒害作用[4]。
艱難梭菌也可以通過(guò)在厭氧條件下培養(yǎng)而被檢測(cè)。這種方法具有很高的靈敏度，但是也很耗費(fèi)時(shí)間，需要超過(guò)三天的時(shí)間。另外，這種方法不能區(qū)分產(chǎn)毒菌株和非產(chǎn)毒菌株。利用EIA對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)分離株進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)試，主要是鑒定艱難梭菌菌株是否產(chǎn)毒 [5]。
傳統(tǒng)的C.diff測(cè)驗(yàn)都是根據(jù)以下三種方法中的一種或者結(jié)合幾種進(jìn)行的：細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中的細(xì)胞毒素檢測(cè)； 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或者毒素A和毒素B的酶免疫測(cè)定（EIA）檢測(cè)； 艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)。[6]
2.1 細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定中的細(xì)胞毒素檢測(cè)
過(guò)濾的糞便抽提物加到微量滴定板上處于生長(zhǎng)的健康的單層細(xì)胞中，培養(yǎng)48h。如果樣本中存在細(xì)胞毒素（一般是艱難梭菌毒素B），將會(huì)導(dǎo)致單層細(xì)胞聚集，脫離板（稱(chēng)為細(xì)胞病變效應(yīng)，CPE）。非特定細(xì)胞毒素的鑒別是通過(guò)加入向第二個(gè)孔（孔內(nèi)有病人的糞便抽提物）加入特定的抗毒素（實(shí)際上是培育一種相似的C. sordellii）。只有起始的CPE是由于艱難梭菌毒素B引起的，在相應(yīng)的孔中抗毒素才會(huì)阻止CPE。一般認(rèn)為，細(xì)胞毒素中和（CTN）測(cè)定是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中最靈敏和精確的，但是存在兩個(gè)主要的缺點(diǎn)：出結(jié)果的速度不夠快，從而影響了及時(shí)的臨床診斷；這種方法需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)和連續(xù)的組織培養(yǎng)[7]。
2.2 艱難梭菌毒素A、腸毒素、或毒素A和毒素B的酶免疫測(cè)定（EIA）檢測(cè)
一些商業(yè)產(chǎn)品通過(guò)檢測(cè)在主要存在于有生長(zhǎng)力的艱難梭菌細(xì)胞的一種蛋白質(zhì)，叫谷氨酸脫氫酶（GDH），結(jié)合毒素檢測(cè)。因?yàn)榧S便中的毒素易分解，特別是如果在轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室的過(guò)程中經(jīng)過(guò)耽誤，毒素測(cè)驗(yàn)很可能會(huì)錯(cuò)誤地成陰性，然而GDH是相當(dāng)穩(wěn)定的，通?？梢员砻魑⑸锏拇嬖凇＿@種方法的缺點(diǎn)包括缺乏靈敏性，一些菌株毒素的改變使得不能被商業(yè)化產(chǎn)品檢測(cè)出來(lái)；一些無(wú)毒素的艱難梭菌也可分泌出GDH（假陽(yáng)性結(jié)果）；一次進(jìn)行這些檢測(cè)的費(fèi)用；如果EIA測(cè)驗(yàn)是成批進(jìn)行以提高工作流程和成本效益，將會(huì)使周轉(zhuǎn)時(shí)間延長(zhǎng)。
2.3 艱難梭菌的厭氧培養(yǎng)
培養(yǎng)是所有檢測(cè)中最靈敏的方法。但是必須進(jìn)行二次檢測(cè)以判斷產(chǎn)物毒素是否存在，因?yàn)榉嵌拘跃赀€是比較常見(jiàn)的。這就延長(zhǎng)了出結(jié)果的周轉(zhuǎn)時(shí)間。另外，艱難梭菌的芽孢是極其堅(jiān)固的，但是有生長(zhǎng)力的形式卻比較脆弱，必須維持厭氧環(huán)境以使其恢復(fù)生長(zhǎng)。一種特殊的介質(zhì)——環(huán)絲氨酸-頭孢西丁果糖瓊膠（CCFA），必須在厭氧環(huán)境下儲(chǔ)存并培養(yǎng)48h，以達(dá)到最佳的恢復(fù)。因?yàn)榕囵B(yǎng)技術(shù)的困難和結(jié)果輸出的延遲，在相對(duì)很少的檢測(cè)性實(shí)驗(yàn)室中會(huì)對(duì)艱難梭菌進(jìn)行培養(yǎng)。早先的研究區(qū)分疾病通常包括在內(nèi)鏡檢查術(shù)下宏觀觀察粘膜的外觀，通過(guò)組織病理學(xué)比較（假膜是由剝落的細(xì)胞組成的白色或者黃色粗糙的物質(zhì)構(gòu)成），或者在結(jié)腸粘膜的活體組織上觀察到的的微觀病變。目前這種有擴(kuò)散性的檢測(cè)在今天已經(jīng)幾乎不被利用了，實(shí)驗(yàn)室測(cè)驗(yàn)是檢測(cè)的主要模式。這使得測(cè)驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)的選擇至關(guān)重要。
最近已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道了采用兩步方法后的更好的結(jié)果：對(duì)微生物本身非常靈敏的檢測(cè)，首先利用EIA檢測(cè)GDH，緊接著對(duì)細(xì)胞毒素和中和的二次檢測(cè)。因?yàn)樵谒胁∪说募S便標(biāo)本中的艱難梭菌，對(duì)GDH的快速檢測(cè)將都是陽(yáng)性的，不管毒素的性質(zhì)是否已經(jīng)在運(yùn)輸過(guò)程中分解，這種方法是最靈敏的。糞便在其最初的檢測(cè)中被認(rèn)為是陰性的，即可立刻被報(bào)告時(shí)陰性的。因?yàn)榈谝粋€(gè)樣本是最有價(jià)值的?？醋o(hù)者可以進(jìn)行其他的檢測(cè)方法，并使得改變抗生素療法決定的立即必要性得到阻止。實(shí)驗(yàn)室必須繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞毒素測(cè)定，這使得周轉(zhuǎn)時(shí)間增加，或者培養(yǎng)和毒素測(cè)驗(yàn)的時(shí)間增加。然而，兩步方法是最有效的。
3 艱難梭菌的快速檢測(cè)方法
目前市場(chǎng)上有很多艱難梭菌快速檢測(cè)方法，其中以Meridian Premier C. difficile Toxin A+B ELISA, TechLab Tox A/B Quik Chek, TechLab Toxin A/B II, ImmunoCard Toxin A&B的檢測(cè)效果相對(duì)較好。ImmunoCard Toxin A&B test最大化地縮短了檢測(cè)時(shí)間，整個(gè)過(guò)程為16-24分鐘。另外，這種測(cè)驗(yàn)是一個(gè)單項(xiàng)測(cè)驗(yàn)EIA，可能在臨時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用上是實(shí)用可行的。其他的快速檢測(cè)方法需要自動(dòng)板閱讀設(shè)備、板清洗機(jī)、或者一些消耗品（如不包括在檢測(cè)試劑盒在內(nèi)的準(zhǔn)備試劑盒等）。大多數(shù)的研究都強(qiáng)調(diào)，需要更加縝密的方法如CTA或者厭氧培養(yǎng)等，以確認(rèn)快速檢測(cè)的結(jié)果。另外，快速檢測(cè)可以用來(lái)作為鑒定艱難梭菌陽(yáng)性個(gè)體的初步的篩選方法，可以減少在艱難梭菌感染檢測(cè)的延誤。但是這些快速檢測(cè)普遍存在靈敏度低和陽(yáng)性預(yù)測(cè)值率等缺點(diǎn)[5]。因此，臨床上迫切需要一種快速靈敏的艱難梭菌檢測(cè)方法。
4 艱難梭菌分子生物學(xué)檢測(cè)方法
目前的有研究表明，利用分子學(xué)方法進(jìn)行艱難梭菌檢測(cè)更有效[12,13]。 Peterson 等評(píng)價(jià)了real- time PCR檢測(cè)是利用引物以毒素B基因的一段保守區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn)。 由于所有產(chǎn)毒菌株都攜帶毒素B（有些缺少毒素A），這被視為是產(chǎn)毒菌株的很好的替代標(biāo)記。
這個(gè)研究是分兩個(gè)階段進(jìn)行。第一階段是將送到實(shí)驗(yàn)室的618個(gè)艱難梭菌檢測(cè)標(biāo)本，進(jìn)行普通的EIA測(cè)驗(yàn)與PCR測(cè)驗(yàn)比較。與結(jié)合毒素測(cè)驗(yàn)的厭氧培養(yǎng)的金標(biāo)準(zhǔn)比較，EIA的靈敏度為67%，精確度為92%，而PCR的靈敏度為94%，準(zhǔn)確度為97%。在這個(gè)階段，調(diào)查者還設(shè)定了一套明確艱難梭菌相關(guān)性腹瀉診斷的標(biāo)準(zhǔn)，并發(fā)現(xiàn)幾乎所有真正的CDAD病例每天會(huì)有3次或者更多的排便。對(duì)符合該標(biāo)準(zhǔn)的采自病人的370個(gè)標(biāo)本，PCR檢測(cè)的靈敏度比EIA的更高（93% vs. 73%）。real-time PCR和厭氧培養(yǎng)測(cè)定皆比酶免疫測(cè)定（EIA）更加靈敏(P<.01 to P<.05)。作者總結(jié)，與EIA相比，real-time PCR是一個(gè)更加靈敏，相對(duì)迅速的測(cè)驗(yàn)，應(yīng)該在臨床實(shí)踐中考慮替代用來(lái)檢測(cè)毒性艱難梭菌的酶免疫測(cè)定。
目前市場(chǎng)上推出的艱難梭菌快速分子檢測(cè)有BD GeneOhm real-time PCR test和Cepheid公司的GeneXpert C. difficile快速檢測(cè)方法等。Stamper等（2009）評(píng)價(jià)了BD GeneOhm real-time PCR test的檢測(cè)效果，引用的標(biāo)準(zhǔn)是商業(yè)化應(yīng)用的CTA（Wampole C.difficile Toxin B test）。通過(guò)研究表明，GeneOhm的靈敏度為83.6% (95% CI: 74.3% to 92.9%) ，精確度為98.2% (96.8% to 99.6%)，PPV 和NPV分別為 89.5% (81.5% to 97.4%) 、97.1% (95.3% to 98.9%)。整個(gè)GeneOhm real-time PCR test大概需要3h，而一般CTA需要24-48h，厭氧培養(yǎng)的時(shí)間大約為5天。作者總結(jié)認(rèn)為，GeneOhm是一個(gè)快速靈敏的C.difficile分子檢測(cè)方法[14]。
而Cepheid公司推出的GeneXpert C. difficile快速分子檢測(cè)，具有更強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)。整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需要30分鐘。與肉湯富集產(chǎn)毒培養(yǎng)進(jìn)行比較，其靈敏度為93.5%，精確度為94.0%。與現(xiàn)有的PCR檢測(cè)、細(xì)胞毒素測(cè)定、EIA等各種檢測(cè)方法比較，其具有高度的靈敏度。因此，相比之下，GeneXpert C. difficile檢測(cè)是一種更加快速、靈敏的檢測(cè)方法。
|
深圳市豪地華拓生物科技有限公司